技术文章/ARTICLE
养细胞中有小黑点，是碎片or污染，如何防范处理
点击次数：3705 发布时间：2022/2/22 13:37:38
养细胞中有小黑点，是碎片or污染？如何防范处理
相信很多养细胞的新手都遇到过，在养细胞中，细胞在显微镜下观察小黑点，背景比较脏。遇到这样的问题又不知道怎么去辨别细胞情况！！！
如果在显微镜下观察到了小黑点，基本上可以将范围缩小到是细菌污染还是细胞碎片。到底是污染还是碎片，可从以下几个方面进行判断：
1、运动性：很多会动的小黑点，只是发生布朗运动的细胞碎片。从运动性上比较，浮躁的细菌活跃的多。
2、培养基的浑浊度：如果在显微镜下无法辨认，那就交给时间吧。细胞培养基对于细菌来说是非常营养的大餐。一旦发生污染，细菌就会大量繁殖。培养基PH值迅速下降，培养基变黄且会变浑浊。通常在12小时内就可以发现，而在48小时内就非常明显。被污染的细胞培养基变黄且浑浊、未被污染的细胞培养基偏红且澄清。
3、接种平板：将怀疑污染物接种在微生物培养平板中，观察菌落形成情况。碎片？细菌？一目了然。
对于养细胞的小伙伴，污染是避之唯恐不及，防范于未然更重要。
哪些步骤容易发生污染？
容易导致细菌污染的一个步骤就是细胞在水浴锅解冻后没有消毒。如果这个步骤发生污染的话，细胞接种24小时之内就会明显观察到细胞污染。另外几个可能导致污染的操作是：放培养基的瓶子或者管子在用水浴锅预热后，没有消毒。实验员在操作过程中枪头有可能接触到被污染的部分而导致细胞污染。为了防止这种情况，容器外表面包括帽子应喷洒75%乙醇消毒，然后用无菌棉垫擦干。
实验员在操作过程中，移液器的枪尖可能会碰到超菌台内壁或者超菌台内放置的其他瓶子或设备，有时可能会碰到包含细胞的细胞培养瓶外表面，甚至会碰到手套，或者实验操作服的袖口。以上所提到的任何一项操作失误，都会导致细菌污染。
保持无菌工作区是防止细胞污染的方式：
1、使用和使用后，用75%乙醇对所有工作表面进行消毒。如果操作过程发生液体溢出的情况，这一项特别重要；
2、保持一个整洁的工作空间；工作区应该只包含必须的实验设备；
3、在实验之确保已经准备好所有需要的试剂和耗材，避免反复进出操作区；
4、整个实验操作在经过消毒的超菌工作台或者生物安全柜中进行。超净工作台或者生物安全柜可以通过紫外线和75%乙醇结合的方式消毒；
5、经常清洁用于细胞培养的水浴锅，经常对细胞培养箱进行消毒。
细胞碎片应该怎么处理：
1、细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡及细胞器折光，折光属于细胞自身特性，无法清除也无法改变。
2、细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片和细胞已经分泌的分泌泡，可以先换液后用PBS润洗清除，润洗不能清除的可以消化完成后加培养基终止消化，混匀细胞，收集细胞悬液900-1000rpm(约150g)离心3min，弃上清。再加5ml PBS重悬细胞，再离心后，用培养基重悬接种到新的培养皿。第二次PBS重悬是为了去除碎片，如果平时碎片比较少，传代时可以省略PBS重悬的步骤；如果碎片很多，建议PBS多洗几次。
培养基污染应该怎么处理
1、在使用和使用后，用75%乙醇对培养基和其他试剂瓶子的外表面进行消毒。此外，不要让试剂瓶口敞开过长时间；
2、尽可能将培养基和其他需要的试剂分装。如果在在操作过程中发生错误操作，不好再使用；
3、在操作培养基时，请使用一次性的塑料或者玻璃的无菌移液管。每个吸管只有一次，以避免交叉污染；
4、每天用显微镜观察细胞，密切注意培养基的浑浊度；
5、避免和其他人共同使用培养基和其他试剂；
6、每个细胞系使用一瓶培养基。这样可以有效避免交叉污染；
7、一次只操作一个细胞系，避免细胞之间的交叉污染；
细胞被污染了应该怎么处理：
1、细菌污染
1.1、细菌污染的细胞，培养基会明显浑浊，静置后会在底部形成一层沙状物，显微镜下观察细胞被细菌包围死亡。
1.2、细菌污染检测，可以取细胞培养上清1ml左右，接种到3ml LB培养基，摇菌过夜。若培养基明显变浑浊，则证明细菌污染；若无明显变色，证明无污染。
1.3、细菌污染的细胞处理后及时丢弃，不会对其他细胞造成影响。
1.4、细胞碎片应注意与细菌、真菌污染区分，主要区别在于细胞碎片不会明显增殖，而细菌、真菌在过夜后即可明显观察到增殖，甚至遮蔽细胞。
1.5、细菌污染一般在污染源进入后1-2天即可爆发，故发现污染时可以自行溯源。
2、真菌污染
2.1、真菌污染的细胞，显微镜下可以明显看到树枝状霉菌菌丝或其他形态的菌体，肉眼可以看到明显白色斑点或者培养基内颗粒状物质漂浮。
2.2、真菌无须检测，显微镜及肉眼即可分辨。
2.3、真菌污染的细胞，处理后及时丢弃，同时需要对培养箱及操作台进行消毒处理，避免污染其他细胞。
2.4、真菌污染一般在污染源进入2-4天内即可爆发，发现污染时可以自行溯源。
3、支原体污染
3.1、支原体污染在国内是普遍存在的问题，大部分实验室缺乏检测及控制支原体污染的方法，导致有很大比例的细胞含有支原体污染。
3.2、支原体检测方式多种多样，PCR、荧光法、培养法、试剂盒等，不同实验方式检测的灵敏度、特异性、针对的支原体类型都不太一样，所以各种检测方法检出结果有时会有出入。即同一个样本，有的方法检出阳性，有的阴性，有的强有的弱。
3.3、支原体处理的，用6孔板培养，每天换液，细胞长满就传代丢弃部分，基本可以2-3周清除干净。
相信很多养细胞的新手都遇到过，在养细胞中，细胞在显微镜下观察小黑点，背景比较脏。遇到这样的问题又不知道怎么去辨别细胞情况！！！
如果在显微镜下观察到了小黑点，基本上可以将范围缩小到是细菌污染还是细胞碎片。到底是污染还是碎片，可从以下几个方面进行判断：
1、运动性：很多会动的小黑点，只是发生布朗运动的细胞碎片。从运动性上比较，浮躁的细菌活跃的多。
2、培养基的浑浊度：如果在显微镜下无法辨认，那就交给时间吧。细胞培养基对于细菌来说是非常营养的大餐。一旦发生污染，细菌就会大量繁殖。培养基PH值迅速下降，培养基变黄且会变浑浊。通常在12小时内就可以发现，而在48小时内就非常明显。被污染的细胞培养基变黄且浑浊、未被污染的细胞培养基偏红且澄清。
3、接种平板：将怀疑污染物接种在微生物培养平板中，观察菌落形成情况。碎片？细菌？一目了然。
对于养细胞的小伙伴，污染是避之唯恐不及，防范于未然更重要。
哪些步骤容易发生污染？
容易导致细菌污染的一个步骤就是细胞在水浴锅解冻后没有消毒。如果这个步骤发生污染的话，细胞接种24小时之内就会明显观察到细胞污染。另外几个可能导致污染的操作是：放培养基的瓶子或者管子在用水浴锅预热后，没有消毒。实验员在操作过程中枪头有可能接触到被污染的部分而导致细胞污染。为了防止这种情况，容器外表面包括帽子应喷洒75%乙醇消毒，然后用无菌棉垫擦干。
实验员在操作过程中，移液器的枪尖可能会碰到超菌台内壁或者超菌台内放置的其他瓶子或设备，有时可能会碰到包含细胞的细胞培养瓶外表面，甚至会碰到手套，或者实验操作服的袖口。以上所提到的任何一项操作失误，都会导致细菌污染。
保持无菌工作区是防止细胞污染的方式：
1、使用和使用后，用75%乙醇对所有工作表面进行消毒。如果操作过程发生液体溢出的情况，这一项特别重要；
2、保持一个整洁的工作空间；工作区应该只包含必须的实验设备；
3、在实验之确保已经准备好所有需要的试剂和耗材，避免反复进出操作区；
4、整个实验操作在经过消毒的超菌工作台或者生物安全柜中进行。超净工作台或者生物安全柜可以通过紫外线和75%乙醇结合的方式消毒；
5、经常清洁用于细胞培养的水浴锅，经常对细胞培养箱进行消毒。
细胞碎片应该怎么处理：
1、细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡及细胞器折光，折光属于细胞自身特性，无法清除也无法改变。
2、细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片和细胞已经分泌的分泌泡，可以先换液后用PBS润洗清除，润洗不能清除的可以消化完成后加培养基终止消化，混匀细胞，收集细胞悬液900-1000rpm(约150g)离心3min，弃上清。再加5ml PBS重悬细胞，再离心后，用培养基重悬接种到新的培养皿。第二次PBS重悬是为了去除碎片，如果平时碎片比较少，传代时可以省略PBS重悬的步骤；如果碎片很多，建议PBS多洗几次。
培养基污染应该怎么处理
1、在使用和使用后，用75%乙醇对培养基和其他试剂瓶子的外表面进行消毒。此外，不要让试剂瓶口敞开过长时间；
2、尽可能将培养基和其他需要的试剂分装。如果在在操作过程中发生错误操作，不好再使用；
3、在操作培养基时，请使用一次性的塑料或者玻璃的无菌移液管。每个吸管只有一次，以避免交叉污染；
4、每天用显微镜观察细胞，密切注意培养基的浑浊度；
5、避免和其他人共同使用培养基和其他试剂；
6、每个细胞系使用一瓶培养基。这样可以有效避免交叉污染；
7、一次只操作一个细胞系，避免细胞之间的交叉污染；
细胞被污染了应该怎么处理：
1、细菌污染
1.1、细菌污染的细胞，培养基会明显浑浊，静置后会在底部形成一层沙状物，显微镜下观察细胞被细菌包围死亡。
1.2、细菌污染检测，可以取细胞培养上清1ml左右，接种到3ml LB培养基，摇菌过夜。若培养基明显变浑浊，则证明细菌污染；若无明显变色，证明无污染。
1.3、细菌污染的细胞处理后及时丢弃，不会对其他细胞造成影响。
1.4、细胞碎片应注意与细菌、真菌污染区分，主要区别在于细胞碎片不会明显增殖，而细菌、真菌在过夜后即可明显观察到增殖，甚至遮蔽细胞。
1.5、细菌污染一般在污染源进入后1-2天即可爆发，故发现污染时可以自行溯源。
2、真菌污染
2.1、真菌污染的细胞，显微镜下可以明显看到树枝状霉菌菌丝或其他形态的菌体，肉眼可以看到明显白色斑点或者培养基内颗粒状物质漂浮。
2.2、真菌无须检测，显微镜及肉眼即可分辨。
2.3、真菌污染的细胞，处理后及时丢弃，同时需要对培养箱及操作台进行消毒处理，避免污染其他细胞。
2.4、真菌污染一般在污染源进入2-4天内即可爆发，发现污染时可以自行溯源。
3、支原体污染
3.1、支原体污染在国内是普遍存在的问题，大部分实验室缺乏检测及控制支原体污染的方法，导致有很大比例的细胞含有支原体污染。
3.2、支原体检测方式多种多样，PCR、荧光法、培养法、试剂盒等，不同实验方式检测的灵敏度、特异性、针对的支原体类型都不太一样，所以各种检测方法检出结果有时会有出入。即同一个样本，有的方法检出阳性，有的阴性，有的强有的弱。
3.3、支原体处理的，用6孔板培养，每天换液，细胞长满就传代丢弃部分，基本可以2-3周清除干净。
原创作者：武汉PG电子代理生物技术有限公司
总访问量：164153 